科学家打造时间分辨冷冻电镜新方法，将对分子动力学产生重要影响

“总的来说，这项工作代表了最先进的时间分辨冷冻电镜研究，突显了这种微混合-微喷雾装配体器件在生化应用中的广泛潜力，是对冷冻电镜方法学发展领域和蛋白质翻译领域的重要贡献。”

对于由美国哥伦比亚大学冯相松博士担任第一作者的 Cell 论文，审稿人这样评价称。

图 | 冯相松（来源：冯相松）

目前，冯相松在诺贝尔奖得主、哥伦比亚大学教授约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）课题组从事博士后研究，后者也是本次论文的通讯作者。

总的来说，这项研究致力于时间分辨冷冻电镜方法的开发及应用。通过此，他们不仅解决了一系列的技术瓶颈，也首次发现了原核生物核糖体在 HflX 介导下动态拆分机制。

通过本次研发的时间分辨方法，他们详细分析了 HflX 介导的核糖体拆分的三种瞬时中间状态。通过使用先进的冷冻电镜单颗粒技术，他们重构了中间状态的高分辨率密度图。

一位审稿人直言：“应该承认的是，结构生物学家将会对该方法产生浓厚兴趣，全世界只有 2-3 个研究组有能力进行时间分辨实验并成功获得高分辨率的时间分辨数据，而 Joachim Frank 研究团队就是其中之一。”

研究中，该团队改进了基于微流控芯片的混合喷雾装置，并将其用于时间分辨冷冻电镜样品制备。这种新设计克服了前几代方法上的不足，特别是克服了样品吸附和溶液混合的难题。

据介绍，他们使用 HflX 介导下的核糖体拆分作为模型，来检验这种新器件，并捕获了大小亚基拆分路径上的多个 70S-HflX 瞬时中间态复合物结构。

目前，课题组主要将该方法用于蛋白质翻译相关的生物过程，这中间会有核糖体参与，所以反应系统所涉及的中间产物颗粒尺寸会相对较大。

为了将其用于不同种类的反应体系里，后续他们将尝试应用于膜蛋白上，比如一些谷氨酸受体。这些反应体系涉及受体受谷氨酸的刺激而产生相应的构象变化，而这些动态过程往往很难通过常规的冷冻电镜技术获取。

以往研究发现，这一过程主要发生在几十到数百毫秒，而本次方法在这一时间尺度上非常有效。

另外，在十几到数百毫秒的反应时间内，只要出现了某种中间态构象富集的情形，本次方法都能发挥功效。当然，这也需要多学科科研团队的协同合作。

（来源：Cell）

50% 的反应物都会被吸附？

据了解，在时间分辨的冷冻电镜领域，此前主要有两种技术策略。

第一种是使用微喷-微扩散-微反应的方式。

即将一种反应物，以液滴的形式喷到附有另一种反应物的电镜载网上。这两种反应物以扩散的形式发生混合反应，反应是发生在电镜载网上，所以，反应时间便是样品在载网上的停留时间。

之后，载有反应产物的载网被快速冷冻，使其上的反应溶液层成为玻璃态冰层。

但是，这种方法存在的问题在于：反应物之间的混合均一性不能保证，而且反应液在网上停留的时间越长，溶液中的反应物受气液界面影响越大，导致整体反应质量受到损害。

第二种是使用微混合-微反应-微喷的方式。

首先将两种反应物快速混合，而后让混合液进入反应器内反应一段时间，最后将反应产物以微喷形式转移到电镜载网上。

之后的冷冻过程与上相同，经冷冻之后的样品可用于冷冻电镜图像采集。

但是，第二种方法也并非完美。比如，目前的常用材料是一些聚合物，这些材料表面往往是呈斥水性，对蛋白分子具有非特异性吸附。

而该团队通过研究发现：甚至 50% 的反应物都会被吸附。在这种情况之下，冯相松等人开展了本次研究。

研究中，他先是调研了学界在时间分辨冷冻电镜方法开发上的进展，并对各个方法的优缺点加以分析。

他说：“我们更多是站在前人的肩膀上做研究。甚至在研究尾声，我们不断跟踪这一方法的最新动态，从而更好地把握研究方向。”

此外，冯相松还分析了到底该如何选择微混合器、微反应器和微喷雾器。借助哥伦比亚大学自有的洁净间，他加工出了一款芯片。

然而，初步测试之后他发现了不少问题。比如：器件微通道因承受不了流体压力而被涨破导致溶液泄露；微喷雾器不能与反应器适当连接，造成反应时间不能合理表征。

为此，他进行了多次的摸索返工，最后才产出了目前的设计版本。

由于该课题组主要致力于核糖体的研究，于是他使用原核核糖体 70S 作为基本的生物分子来验证。

研究中，他将 70S 溶液通入所设计的微流控芯片，以微喷的方式将溶液喷到电镜载网上，而后将其快速投入液态乙烷之中加以冷冻，接着在电镜下观察并收集 70S 的成像。

“当然我们也做蛋白分子的吸附测试，借此确定本次芯片能够保持蛋白分子通入芯片的前后一致性。”冯相松说。

此外，针对不同的生物反应体系，还得进行具体分析。基于前人的研究分析，他设计了四个时间点：10 毫秒、25 毫秒、140 毫秒、900 毫秒，然后分别让一组微流控芯片来抓取反应过程中的瞬时构象颗粒。

与传统样品制备不同的是，由于每一个液滴在载网上的铺展情况各不相同，这让数据收集变得尤为困难。

研究之后他发现，靠近网格条附近的液滴层区域，能够有效地收集高质量的电子显微照片，从而可以大大提高数据收集效率。通过此，他一共收集到包括对比实验在内的 5 个数据集。

“当然，相信未来通过使用深度学习算法，可以帮助识别有效数据收集区域，从而有望进一步提高数据收集的速度和质量。”冯相松表示。

而所有生物故事的阐述，都是基于数据处理和数据分析所得的结果。经过初步筛选，他将大约一万五千张电子显微照片放在一起处理。

然后，使用专业软件针对电子显微照片，进行电子束引起运动的漂移矫正，借此确定每张图片衬度传递函数的参数。

并对照片上的分子颗粒识别挑选，通过 2D 分类的方法得到大约一百万个颗粒图像。

后又历经数轮的 3D 分类和精修重构，冯相松最终得到三个较高分率的中间态结构。

而为了研究动态过程，他又追踪了不同时间点上的颗粒族群对于每一个中间态构象的贡献，从而确定它们在反应过程发生的先后顺序。与此同时，他还建立了大量模型。

（来源：Cell）

最终，相关论文《基于 PDMS 的微流控芯片组件在冷冻电镜中的时间分辨率及其在 HflX 介导的原核核糖体回收研究中的应用》（Time resolution in cryo-EM using a PDMS-based microfluidic chip assembly and its application to the study of HflX-mediated ribosome recycling）为题发表在 Cell[1]。

冯相松和萨彦·巴塔查吉（Sayan Bhattacharjee）是第一作者，约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）和冯相松担任共同通讯作者。

图 | 相关论文（来源：Cell）

“你敢把诺奖得主的方案给否了？”

冯相松表示：“可以说我是幸运的，在博士毕业后就直接加入现在的团队。我拿的是机械工程的博士学位，而又受邀加入世界一流的研究团队，致力于冷冻电子显微镜技术开发和蛋白质翻译研究。”

他继续说道：“我所学的专业，跟这个团队似乎很难交叉到一起。因此我现在依然对我导师约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）在用人上的魄力感到惊讶，这也算是我博后生涯的一个难忘的开始。”

本次研究伊始，冯相松的导师对于反应器的设计提出了一个方案，他照做之后发现方案并不可行。

他说：“估计好多人会问，你敢把诺奖得主的方案给否了？我当然不敢着急把我所发现的事实告诉他，反而花时间弄明白了方案不可行的原因。”

令冯相松惊讶的是，当他告诉导师方案行不通的原因，导师并没有坚持，反而尊重客观事实，通过此他们提出以微玻璃毛细管作为微反应器的方案。

当本次研究还在进行之时，很多课题组发表出一个又一个基于微流控芯片的时间分辨的冷冻电镜方法，而该团队却在进度上停滞不前。

“但这并没有打乱我们的阵脚，我们反而继续和导师开展规律的线上会议。通过此，我们发现了芯片微流道内壁吸附蛋白分子严重的问题，并找到了有效的解决方案。”冯相松说。

但是，在其他课题组的论文中，这一问题却被忽略了。由此可见，论文注重是研究内容及其重要性，发得慢不要紧，有时关键在于发得好。

而基于本次研究的后续计划，目前已有三个课题正在进行：一个是核糖体的大小亚基的结合动态研究，一个是真核细胞翻译的起始动态研究，一个是真核细胞翻译的终止动态研究。

目前，他们已经获得一些可观的数据，他们相信本次方法也会更加完善，也希望这一方法能被更多课题组所采纳。

参考资料：

1.Bhattacharjee, S., Feng, X., Maji, S., Dadhwal, P., Zhang, Z., Brown, Z. P., & Frank, J. (2024). Time resolution in cryo-EM using a PDMS-based microfluidic chip assembly and its application to the study of HflX-mediated ribosome recycling.Cell. DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.12.027

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