CELL|皮肤衰老细胞可被免疫细胞清除！衰老+免疫还不快来看~~~

撰写： 科研蒂 来源：小张聊科研平台的“ 课题指南针”公众号，微信公众号搜索“ 课题指南针”即可关注/扫描关注见文末

2013年，The hallmarks of aging刊登在Cell上，最新版本又于2022年发表。截止到今年-2023年，近300,000篇有关衰老主题的文章发表。科研工作者探讨着衰老在正常发育中的关键生理作用、衰老引发年龄相关性疾病发生发展、衰老细胞在肿瘤中的发现……衰老和衰老相关分泌表型（Senescence Associated Secretory Phenotype, SASP）持续火热！2023年3月30日关于衰老的又一重磅研究来袭：

来自哈佛医学院的Shadmehr Demehri团队在Cell上发表了题为Cytotoxic CD4+ T cells eliminate senescent cells by targeting cytomegalovirus antigen的文章，研究发现HCMV-gB特异性CD4 CTLs有助于清除老年人皮肤中衰老的成纤维细胞。赶紧看看这一发现是怎么阐明的吧。

小知识

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV )是β-疱疹病毒家族的一员。一般来说，巨细胞病毒感染不引起任何临床症状，严重感染通常发生于出生前感染病毒的婴儿和免疫功能低下者。

研究人员收集了800份来自不同年龄包含多个躯干部位的皮肤样本，按照年龄划分为年轻组（n=23，平均年龄：23.1）和老年组（n=31，平均年龄62.1）。排除紫外线辐照、解剖位置、性别差异、毛囊密度等混杂因素，研究人员首先确定①具体衰老细胞群②衰老细胞年龄相关性。p16INK4a免疫荧光结果观察到衰老细胞主要分布在真皮。超过80%的p16INK4a阳性细胞表达vimentin，且为PDGFRα阳性细胞，确定了老年人真皮中大部分衰老细胞是成纤维细胞（p16INK4a+p21+ vimentin+GL13+ fibroblast）。年轻组与老年组相比，皮肤衰老细胞数量与年龄正相关。然而在老年组中，衰老细胞数量与年龄的增长没有任何显著相关性。那么，是什么因素控制老年人皮肤衰老细胞的累积呢？

为了确定调节衰老皮肤中衰老细胞积累的因素，研究人员先排除了即使存在差异但与衰老细胞数量没有显著相关性的表皮状态、血液或淋巴管密度因素。通过对皮肤组织切片多重免疫染色发现几种固有免疫和适应性免疫细胞在老年组真皮中高度富集。接下来③确定免疫监测细胞群。老年组皮肤样本中，perforin+细胞毒性CD4+ T细胞（CD4 CTLs）与衰老细胞数量呈负相关。scRNA-seq确定CD4+ T细胞特征：表达PRF1（perforin）,CD69，细胞毒性相关基因RUNX3、RAB27A、KLRK1（NKG2D）。④确定衰老细胞招募CD4 CTLs因素。对两组皮肤样本进行RNA-seq，发现免疫相关基因在两组皮肤样本中显著改变，主要关注在老年组样本中高表达的CXCL9（CXCL9趋化因子作为CD4 CTLs CXCR3的配体）。免疫荧光发现CXCL9+细胞定位于表皮基底层。在老年组中，查看CXCL9与CD4 CTLs、衰老细胞的相关性，将样本根据CXCL9的表达水平分为CXCL9-high、CXCL9-low两组。CXCL9-high样本中CD4 CTLs数量更多且衰老细胞更少。体外Trans-well实验验证了CXCL9可以诱导CD4 CTLs迁移。

⑤确定免疫细胞活化双信号。研究人员构建细胞模型，通过重复传代诱导细胞复制性衰老在体外生成衰老的人皮肤成纤维细胞（模拟受阳光保护衰老皮肤中的细胞衰老），SA-β-Gal染色检测衰老表型。RNA-seq发现在衰老细胞中，细胞毒性淋巴细胞识别的配体表达变化显著，ULBP2（NKG2D的配体）表达显著上调。流式细胞术确定ULBP2在衰老细胞表面高表达。免疫荧光检测p16INK4a、vimentin、ULBP2共定位，老年组皮肤样本中ULBP2+衰老成纤维细胞的数量显著增加。使用以上检测方法确定了衰老成纤维细胞高表达HLA-Ⅱ。在UVA辐照诱导衰老的成纤维细胞模型中，细胞表面ULBP2和HLA-Ⅱ水平同样显著升高。

⑥CD4 CTLs以HLA-Ⅱ依赖方式清除衰老成纤维细胞。研究人员构建细胞模型，将正常和复制诱导的衰老成纤维细胞与从人类皮肤中分离的免疫细胞（同种异体/自体）共培养。自体T细胞诱导衰老细胞凋亡（检测指标cleaved caspase-3）。在基因层面使用siRNA干扰CIITA（HLA-II基因表达的主调控因子）表达，蛋白层面使用HLA-DR抗体，均可阻断自体T细胞诱导衰老细胞凋亡。流式细胞术分析了被衰老细胞招募的CD4+T细胞，高表达CD107a、CD137、IFNγ。

⑦CD4 CTLs通过靶向HCMV-gB抗原消除衰老成纤维细胞。衰老成纤维细胞表面HLA-II呈递的是哪种抗原呢？HCMV感染在美国人群中十分普遍，95%的健康个体血液中能够发现HCMV-gB特异性CD4+T细胞。此项研究中，老年组HCMV血清阳性超过90%，高于年轻组的血清阳性率。在皮肤样本中可以检测到HCMV的DNA（qPCR）和RNA（ISH），免疫荧光（HCMV抗原检测抗体cocktail）检测HCMV阳性细胞。组织样本中，老年组HCMV-gB阳性细胞显著增多。细胞模型中，复制和UVA诱导的衰老成纤维细胞中HCMV DNA、HCMV-gB水平升高，HCMV-gB定位于内体，加工后置于HLA-II。那么CD4 CTLs对于HCMV-gB的反应如何呢？已知CD4 CTLs的TCR中β-链TRBV6-5可以识别HLA-DRB*0701呈递的HCMV-gB。对HLA-DRB*0701阳性的老年皮肤样本进行TCR-seq，检测到表达TRBV6-5的T细胞克隆。研究人员用含有gB衍生多肽（DYSNTHSTRYV）与HLA-DRB1 07:01(DR7)位点结合的HLA-多肽四聚体对年轻组和老年组样本中分离的T细胞进行染色，检测（流式细胞术）发现老年人皮肤中存在HCMV-gB特异性CD4 CTLs。在共培养细胞模型中，大多数凋亡的衰老成纤维细胞表达HCMV-gB，HLA-DR抗体能够阻断衰老细胞的凋亡。同时，HCMV-gB能够特异性诱导CD4 CTLs表达IFNγ。

以上，HCMV-gB特异性CD4 CTLs有助于清除老年人皮肤中衰老的成纤维细胞。

总结讨论：这篇研究发现人体免疫系统已经进化到与HCMV建立共生关系，并借病毒的抗原性清除衰老细胞，令人啧啧称奇。之前的研究发现HCMV 感染的原代人胚肺成纤维细胞和成体二倍体成纤维细胞可上调p16INK4a，细胞感染早期呈现复制性衰老状态，并显著增加病毒感染的细胞数量。本项研究发现复制性衰老和UVA诱导的衰老激活了HCMV，但IE1/IE2的低表达显示其并没有进入高复制水平，并且皮肤组织内并未存在裂解性感染情况，抑制了病毒的传播。疱疹病毒优先下调HLA-I的表达，而不是HLA-II，这使得CD4 CTLs在清除病毒感染细胞中发挥突出作用。因此，细胞衰老可能作为一种天然的抗病毒防御机制，通过抑制裂解性病毒的传播，同时创建免疫原性靶点对自身进行清除。最后提出了一种针对衰老细胞清除的转换策略——接种HCMV抗原疫苗，以增强抗HCMV T细胞免疫并预防衰老和衰老相关疾病。

研究局限性：HCMV血清状态展现的衰老细胞免疫监视情况待了解。缺乏体内证据证明HCMV特异性CD4 CTL免疫能否预防衰老和衰老相关疾病。没有被HCMV感染过的（老年人）人体，其皮肤衰老的成纤维细胞能否被清除？是怎样被清除的呢？

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/mNztJ_d_Whce_eZsa1_jlg