食品中N-亚硝胺类化合物的测定

本文转自：中国市场监管报

N-亚硝胺一般结构为R2（R1）N-N=Ｏ，即一个亚硝基（NO）和一个仲胺基的氮原子相互键合，是国内外公认毒性较大的污染物，是一类强致癌物，对肝脏器官有毒性和致癌作用。亚硝胺种类众多，目前发现的亚硝胺类化合物主要分成三类：挥发性亚硝胺、烟草特有亚硝胺和难挥发性亚硝胺。

亚硝胺在自然界中分布十分广泛，在空气、水源等中都有亚硝胺发现。部分食品中也存在亚硝胺，如肉制品加工过程中使用的食品添加剂含亚硝酸盐，而亚硝酸盐在腌肉中可以转化成亚硝酸，其极易和次级胺类物质反应生成致癌性物质N-亚硝胺类化合物；在啤酒酿造过程中，大麦芽在窖内直接用火加热干燥时，产生N-二甲基亚硝胺。值得一提的是，在腌制水产制品过程中，若原料不新鲜，在微生物的作用下，水产品存在的天然胺类物质可经亚硝化反应生成亚硝胺。因此，在食品中的水产品中，如果储存不当或者不新鲜很容易检测出N-亚硝胺化合物，这也是2024年食品安全监督抽检实施细则中新增的检测类别，在抽检过程中需要特别留意这些高风险产品。

N-二甲基亚硝胺的食品国家安全标准为GB 5009.26-2023，该标准于2023年9月6日发布，2024年3月6日正式实施。方法包括第一法水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法、第二法QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法、第三法水蒸气蒸馏-液相色谱-质谱/质谱法、第四法气相色谱-热能分析仪法。本次主要解读第一法和第二法的标准适用范围、基本原理、操作注意事项、关键质量控制措施等。

标准适用范围与基本原理

标准规定了食品中N-亚硝胺类化合物测定的方法。标准中的检测方法都适用于肉与肉制品、水产动物及其制品。

第一法（水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法）的基本原理：样品中加入内标，经水蒸气蒸馏，样品中的N-二甲基亚硝胺通过二氯甲烷吸收，液液萃取分离，采用气相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量。

第二法（QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法）的基本原理：样品中加入内标，样品中的N-二甲基亚硝胺通过乙腈提取，基质分散萃取填料净化，采用气相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量。

样品前处理

第一法：称取20g样品，加入适量内标，加入100mL水和50g氯化钠于蒸馏管中，在250mL三角瓶中加入50mL二氯甲烷和0.5mL异辛烷，冷凝管出口伸入液面以下，三角瓶冰浴，收集约250mL冷凝液；在装有蒸馏液的三角瓶中加入15mL氯化钠和2mL硫酸溶液，将溶液转移至500mL分液漏斗中，振荡静置分层，将二氯甲烷层放至圆底烧瓶，再用120mL二氯甲烷分三次萃取，合并萃取液，萃取液用10g无水硫酸钠除水后旋蒸，再氮吹至近干，定容至1mL。

第二法：干制品称取5g(精确到0.01g)于50mL离心管，加入5mL水，振荡混匀【鲜样品称取10g（精确到0.01g）置于50mL离心管中】，加入N-二甲基亚硝胺内标中间液(1μg/mL) 50μL，向其准确加入10mL乙腈，涡旋振荡2min，置于-20℃冰箱冷冻20min，加入陶瓷均质子1粒以及4g硫酸镁和1g氯化钠，涡旋振荡2min，置于冷冻离心机中，转速9000r/min，10℃离心5min，上清液待净化；称取150mgPLS-A粉末(或1g增强型脂质去除EMR-Lipid萃取粉剂或同级品)于15mL离心管中，加入5mL水涡旋振荡，立即加入5mL上清液涡旋振荡1min，置于冷冻离心机，9000r/ min，10℃离心5min；称取1.6g硫酸镁和0.4g氯化钠于另一15mL离心管，加入净化液涡旋振荡2min，置于冷冻离心机中，转速9000r/min，10℃离心5min。取上层有机相经0.22μm微孔滤膜过滤后，上机测量。

新标准较旧标准更新内容：新标准修改第一法气相色谱-质谱法为水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法，其采用内标法，取样量从之前的200g变为20g，在二氯甲烷接收液中加入0.5mL异辛烷可增大沸点，仪器条件从SIM模式变为MRM模式，灵敏度提高。新标准中增加了第二法QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法和水蒸气蒸馏-液相色谱-质谱/质谱法。

操作注意事项

试样制备。检验样品、复检样品的包装个数和总量需要满足标准要求。样品取可食用部分捣碎后，制备成均匀试样，装入洁净容器密封并做好标识，在-18℃环境下冷冻保存，备用。样品均匀性对指标检测起着至关重要的作用。

标准溶液。要注意考察N-二甲基亚硝胺标准品溶液的储存稳定性，可做好不同储存条件下标准品期间核查，以考察其稳定性。注意第一法中N-二甲基亚硝胺标准溶液应使用二氯甲烷作为介质；第二法中N-二甲基亚硝胺标准溶液使用乙腈作为介质。

提取净化。第一法中，提取步骤注意蒸馏时接样导管出口应浸入锥形瓶中的二氯甲烷液面以下，并注意检查蒸馏装置的气密性，接收蒸馏水由于温度过高需用冰袋冰敷接收容器；在净化步骤，分液漏斗萃取时，需充分摇匀，并且静置后取下层溶液，注意观察分液漏斗壁上附着的二氯甲烷，应再次摇匀、静置放出；在浓缩过程，注意不能吹干，应吹至近干（大约0.3mL～0.8mL)，再用二氯甲烷定容至1mL。

第二法中，加入10mL乙腈振荡摇匀后，注意须置于-20℃冰箱冷冻20min，使蛋白油脂沉淀；净化时，为实现最佳的杂质去除效果，添加水活化步骤至关重要；除水步骤建议在加入净化液后立即摇散，再涡旋振荡2min，避免结块。

仪器分析系统。亚硝胺类化合物具有强极性和强挥发性，在低极性或中等极性色谱上保留时间较短且容易拖尾，在食品基质中更容易受干扰物质的影响。在标准中参考色谱柱为强极性色谱柱或性能相当者。在实验过程中，由于不同基质的原因，在目标峰附近可能出现干扰峰，可采用程序升温等方式进行条件优化。

实验室安全操作。亚硝胺是国际公认毒性较大的污染物，应避免与身体直接接触，操作时请注意穿戴好手套、口罩、实验服等。实验室整个分析过程应在指定区域内进行，该区域应避光（直射阳光），具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。

关键质量控制措施

日常检测实验中，为实现结果的准确可靠性，可以通过以下两方面进行质量控制：

质控手段：空白控制，试验中需要开展随样品空白试验，并且日常收集空白水平；加标回收，关注加标回收率的范围，同时关注内标的绝对回收率；质控样，购买与试样相同基质的质控样，试验中随样品一起进行实验操作；实验室间比对，将阳性样品送去外部实验室比对，确保数据准确可靠；还可通过仪器比对、人员比对、留样再测等方式验证结果的准确性。

数据积累：日常需要收集和积累常见样品中N-二甲基亚硝胺的含量水平，尤其关注高风险类别，如水产制品，能识别出结果偏高或偏低时的异常。

□四川省食品检验研究院 张慧祺